רובנו נחשף לביטוי PCR בפעם הראשונה בזמן מגפת הקורונה, בין שנת 2020 ל-2022. ניכר וברור היה שמדובר בבדיקה לאיתור נוכחות הנגיף, אבל איך זה מתבצע בדיוק ומה ההבדל לעומת בדיקות אחרות?
מה זה PCR?
פי.סי.אר (קיצור של Polymerase Chain Reaction - "תגובת שרשרת פולימראז") היא שיטה לניתוח רצף קצר של DNA או RNA, גם בדגימות המכילות כמויות קטנות בלבד של החומר הגנטי.
למעשה, בדיקת פי.סי.אר מיועדת לשחזור / הגברה של קטעים נבחרים מתוך DNA או RNA. הגברה זו מאפשרת לאבחן בקלות רבה יותר את נוכחותם של חומרים ספציפיים, כגון וירוסים. בעבר, הגברה של DNA הצריכה שיבוט של המקטעים הרלוונטיים לכדי וקטורים הבאים לידי ביטוי בחיידקים, תהליך שנמשך שבועות. כיום, באמצעות בדיקות PCR שנעשות במבחנות, זה לוקח רק כמה שעות.
בדיקת PCR היא תהליך יעיל מאוד, מכיוון שניתן ליצור מספר בלתי מוגבל של עותקים מה-DNA. יתר על כן, PCR משתמש באותן מולקולות שהטבע משתמש בהן להעתקת DNA:
שני "פריימרים" (Primers), רצפי DNA חד-גדיליים קצרים, המסונתזים כך שיתאימו להתחלה ולסיום של ה-DNA המיועד להעתקה.
אנזים בשם פולימראז שנע לאורך מקטע ה-DNA, קורא את הקוד שלו ומייצר עותק.
ולבסוף - ערימה של אבני בניין DNA שהפולימראז צריך כדי ליצור את העותק הזה.
איך עושים בדיקת PCR?
כפי שמודגם בתמונה המונפשת - קיימים שלושה שלבים עיקריים בבדיקת PCR.
שלושת השלבים הללו חוזרים על עצמם במשך 30 או 40 מחזורים, עד שהחומר הגנטי משוכפל בכמויות עצומות לצורך הבדיקה הדרושה. המחזורים מבוצעים במכשיר פי.סי.אר אוטומטי (PCR thermal cycler) המחמם ומקרר במהירות את המבחנות המכילות את התערובת. כל שלב - פרימה (דנטורציה), איחוי והתארכות - מתרחש בטמפרטורה שונה:
פרימה / דנטורציה (Denaturation) - בטמפרטורה גבוהה של 94 מעלות צלזיוס, ה-DNA הדו-גדילי נמס ונפרם לשני מקטעים של DNA חד-גדילי.
איחוי (Annealing) - בטמפרטורות בינוניות, בסביבות 54 מעלות צלזיוס, הפריימרים מזדווגים לזוגות עם ה"תבנית" החד-גדילית (התבנית היא רצף ה-DNA שיש להעתיק). הפולימראז מתחבר עם האורך הקטן של גדילי ה-dna הכפולים (הפריימר והתבנית המחוברים) - ומתחיל להעתיק את התבנית.
התארכות (Extension) - בטמפרטורה של 72 מעלות צלזיוס הפולימראז עובד בצורה הטובה ביותר, ואבני הבניין של ה-DNA, המשלימות לתבנית, מחוברות לפריימר, מה שיוצר מולקולת DNA כפולה.
כאשר מבוצע מחזור אחד, קטע יחיד של תבנית DNA דו-גדילי מוגברת לשתי חתיכות נפרדות של DNA דו-גדילי. שני החלקים הללו זמינים לאחר מכן להגברה במחזור הבא. ככל שהמחזורים חוזרים על עצמם, נוצרים יותר ויותר עותקים ומספר העותקים של התבנית גדל באופן מעריכי (ונוצרים טריליונים של עותקים מהחומר הגנטי).
מה המטרה של בדיקת PCR?
כדי לעשות בדיקת פי.סי.אר, ה-DNA המקורי שרוצים להעתיק לא חייב להיות טהור או שופע במיוחד. הוא בהחלט יכול להיות טהור, אבל במקביל אין מניעה שהוא יהיה חלק קטן מתערובת של חומרים. כתוצאה מכך לבדיקת PCR יש שימושים נרחבים ומרובים:
אבחון מחלות גנטיות
בדיקת טביעות אצבע של DNA
איתור חיידקים ווירוסים
חקירת האבולוציה האנושית
שכפול ה-DNA של מומייה מצרית
בדיקת אבהות או קשרים ביולוגיים אחרים
וכן הלאה
בהתאם לכך, PCR הפך לכלי חיוני עבור ביולוגים, מעבדות לזיהוי פלילי של DNA ומעבדות רבות אחרות שחוקרות חומר גנטי.
איך גילו ומי גילה את תהליך הפי.סי.אר?
נושא ה-PCR הומצא על ידי קארי מוליס (Kary Mullis). בזמן שחשב על כך בשנת 1983, מוליס עבד באמריוויל, קליפורניה, עבור Cetus - אחת מחברות הביוטכנולוגיה הראשונות בעולם. בזמן עבודתו שם הוא הואשם ביצירת שרשראות קצרות של DNA עבור מדענים אחרים.
מוליס כתב שהוא הגה את רעיון ה-PCR בזמן שנסע לאורך כביש 128 של חוף האוקיינוס השקט, לילה אחד על האופנוע שלו. הוא שיחק במוחו עם דרך חדשה לנתח שינויים (מוטציות) ב-DNA, כשהבין שבמקום זאת המציא שיטה להגברת כל אזור ב-DNA. מוליס אמר שלפני שנסיעת האופנוע שלו הסתיימה, הוא כבר התענג על הסיכוי לקבל פרס נובל. בסופו של דבר הוא באמת חלק את פרס נובל בכימיה עם מייקל סמית' ב-1993.
כפי שכתב מוליס במגזין Scientific American: "החל ממולקולה בודדת של החומר הגנטי DNA, פי.סי.אר יכול ליצור 100 מיליארד מולקולות דומות בשעות אחר הצהריים. התגובה קלה לביצוע. היא דורשת לא יותר ממבחנה, מעט ריאגנטים פשוטים ומקור חום."
מה זה RT PCR?
בדיקת RT-PCR (תגובת שרשרת טרנסקריפטאז-פולימראז הפוכה - Reverse transcriptase-polymerase chain reaction) היא טכניקה רגישה ביותר לזיהוי וכימות של mRNA (קיצור של רנ"א שליח).
השיטה כוללת שני שלבים:
סינתזה של cDNA (דנ"א משלים) מתוך RNA, באמצעות שעתוק הפוך (RT).
הגברה של cDNA ספציפי על ידי תגובת שרשרת של הפולימראז (PCR).
בדיקת RT-PCR שימשה למדידת עומס נגיפי של נגיף HIV, ועשויה לשמש גם עם נגיפי RNA אחרים כגון חצבת וחזרת.
מה ההבדל בין בדיקת PCR לבדיקת אנטיגן?
כפי שרובנו זוכר, במגפת הקורונה היו שתי בדיקות עיקריות לזיהוי הנגיף - בדיקת אנטיגן ביתית מהירה ובדיקת PCR.
לכאורה, בדיקת אנטיגן מהירה אמורה לקצר את תהליך הזיהוי; אלא שבדיקה זו פחות אמינה מ-PCR. למעשה, בדיקת פי.סי.אר רגישה פי אלף בהשוואה לבדיקת אנטיגן, שעלולה לפספס ולתת תוצאה שלילית.
אומנם בדיקת פי.סי.אר מצריכה בין 10 ל-48 שעות עד לקבלת תוצאה, ובדיקת אנטיגן נותנת תוצאה כמעט מיידית; אבל כאן גם טמונה הבעיה בבדיקות המהירות הללו. כמו כן בדיקת PCR מסוגלת לזהות הדבקה בנגיף גם בלי סימפטומים, ואילו הבדיקות המהירות מוגבלות יותר בזיהוי מסוג זה.
Comentarios