7 במאיזמן קריאה 4 דקות

זיהוי מולקולות בתספיג DNA / RNA / חלבון - שיטות בלוטינג במעבדה

מה זה תספיג (בלוטר)

תספיג (Blotting) הוא שיטה לזיהוי מולקולות ספציפיות מתוך תערובת כלשהי. תהליך זה מבוצע בדרך כלל בשלושה שלבים:

שלב 1 - תערובת המולקולות מופרדת באמצעות ג'ל אלקטרופורזה. התערובת יכולה להיות מסוג DNA או RNA או חלבון, והג'ל יכול להיות אגרוזה (עבור DNA/RNA) או פוליאקרילאמיד (עבור חלבון).
שלב 2 - תוצרי השלב הראשון (חלבונים או חומצות גרעין) מועברים מהג'ל לממברנה שנקשרת פיזית למולקולות עצמן.
שלב 3 - משלבים תוסף חזותי ייעודי למולקולות הרלוונטיות הנמצאות בממברנה. אם המולקולות אכן נמצאות שם, הן יגלו את נוכחותן באמצעות אור.

מדריך בלוטינג למעבדה- זיהוי דנ"א, רנ"א וחלבון

מה ההבדל בין בלוטר DNA, בלוטר RNA ובלוטר חלבון

ניתן לסכם את ההבדלים העיקריים בין שלושת סוגי התספיגים באמצעות הטבלה הבאה:

	בלוטר DNA	בלוטר RNA	בלוטר חלבון
מולקולת המטרה	דנ"א	רנ"א	חלבון
הכנת הדוגמה	מיצוי DNA אנזימטי	בידוד RNA	מיצוי חלבון
הפרדה	אלקטרופורזה	אלקטרופורזה	אלקטרופורזה
חומר הממברנה	ניילון	ניילון	ניטרוצלולוזה או PVDF
אמצעי בדיקה	חומצת גרעין עם רצף התואם למטרה	דנ"א / רנ"א / אוליגו דאוקסי נוקלאוטיד	נוגדן ראשי
תיוג אמצעי בדיקה	תג רדיואקטיבי, אנזים	תג רדיואקטיבי, אנזים	אנזים
שיטת גילוי	סרט צילום רנטגן, הארה כימית	סרט צילום רנטגן, הארה כימית	סרט צילום, CCD מקורר, מצלמה, LED, הדמיית IR

שיטות לביצוע תספיג / בלוטינג DNA

תספיג דנ"א (Southern Blot) משמש לקביעת הזהות, הגודל וכמות הרצפים הספציפיים של DNA. פרוטוקול זה מתחיל עם מיצוי DNA מהתאים או הרקמות, אשר לאחר מכן מתעכל אנזימטית ליצירת שברי DNA.

השברים מופרדים לפי גודל באמצעות ג'ל אגרוזה או פוליאקרילאמיד, באמצעות תהליך של אלקטרופורזה. שברים קטנים ינדדו רחוק יותר על הג'ל מאשר הגדולים.

לאחר האלקטרופורזה, ה-DNA על הג'ל מועבר לממברנת ניילון. הממברנה מודגרת עם חומר בודק העשוי מחומצת גרעין בעלת רצף הומולוגי לרצף המטרה והיא מסומנת באמצעות תג רדיואקטיבי, או צבע פלואורסצנטי או אנזים המסוגל ליצור הארה כימית (כמילומינסנציה).

הכלאה של רצפים משלימים מתרחשת במהלך ההדגרה, והבדיקה ללא הכלאה מוסרת על ידי שטיפה מיוחדת. מולקולות הבדיקה המסומנות בהכלאה מלאה יישארו קשורות לכתם (ועל כן הביטוי Blotting באנגלית).

שיטות הזיהוי משתנות על סמך תווית הבדיקה. בדיקות מסומנות בתג רדיואקטיבי מומחשות עם סרט צילום רנטגן או הדמיית זרחן, ובדיקות שסומנו אנזימטית מומחשות עם מצע כמילומינסנטי.

פרוטוקול עבודה בתספיג דנ"א

בידוד ה-DNA.
עיכול הדנ"א באמצעות אנזים ייעודי. במידת הצורך השתמשו בדנ"א מרוכז.
אלקטרופורזה באמצעות ג'ל - הכינו ג'ל אגרוזה וחוצץ TAE או TBE (בחירת החוצץ תלויה במשך התהליך ובגודל שברי ה-DNA). טענו את הדגימות בפלטת שקעים והוסיפו סמן משקל מולקולרי של דנ"א. הפעלת הג'ל.

העברה:
הניחו את הג'ל במכל עם תמיסת דנטורציה, ושטפו פעמיים במשך 15 דקות על גבי שייקר.
שטפו במים ולאחר מכן בתמיסת נטרול.
במהלך השלב הקודם הכינו נייר סינון ווטמן וממברנת ניילון להעברה.
הרכיבו מנגנון ההעברה עם הממברנה, נייר ווטמן והג'ל - והעבירו בחוצץ SSC או SSPE.
לאחר שההעברה הושלמה, הצליבו את הדנ"א ב-Cross Linker ולאחר מכן שטפו את הממברנה.

טרום הכלאה (חסימה) - חסימה מפחיתה קישורים לא ספציפיים לממברנה. הכינו את תמיסת טרום ההכלאה והוסיפו DNA לדוגמה. הסירו את הכתם מהקרוס לינקר, הוסיפו את תמיסת טרום ההכלאה ובצעו הדגרה.

הכלאה:
הכינו את תערובת הבדיקה (גדיל DNA משלים) וכן חוצץ.
הסירו את תמיסת טרום ההכלאה והדגירו את הכתם עם אמצעי הבדיקה (זמני הדגירה ישתנו בהתאם ליישום).
לאחר ההדגרה, שטפו בעוצמה נמוכה ואחריה בעוצמה גבוהה כדי לעדן את ה-DNA.

זיהוי בדיקה:
שטפו את הממברנה, העבירו למכל עם תמיסה חוסמת ובצעו הדגרה.
היפטרו מהתמיסה החוסמת, החליפו אותה בתמיסת נוגדנים ובצעו הדגרה.
היפטרו מתמיסת הנוגדנים ושטפו את הממברנה.
פעלו לפי הוראות היצרן לזיהוי כמילומינסנטי.

שיטות לביצוע תספיג / בלוטינג RNA

תספיג רנ"א (Northern Blot) משמש לקביעת הזהות, הגודל וכמות הרצפים הספציפיים של RNA. פרוטוקול העבודה מתחיל בבידוד ה-RNA, ושיטות ההפרדה משתנות בהתאם לגודלו.

הרנ"א מופרד בתהליך אלקטרופורזה על גבי ג'ל פורמלדהיד אגרוז או ג'ל גליוקסל אגרוז, המונע חיתוך בסיסים ושומר על ה-RNA במצב דנטורטי. מקטעי רנ"א קטנים מופרדים על גבי ג'ל פוליאקרילאמיד דנטורציה (אוריאה).

לאחר מכן, ה-RNA מועבר מהג'ל לממברנת ניילון אשר מודגרת עם פרוב RNA, DNA או אוליגו דאוקסי נוקלאוטיד - המסומן באופן רדיואקטיבי או לא-איזוטופי. הבדיקה ללא הכלאה מוסרת על ידי שטיפה עם חוצץ.

בדיקות מסומנות בתג רדיואקטיבי מומחשות עם סרט צילום רנטגן או הדמיית זרחן, ובדיקות שסומנו אנזימטית מומחשות עם מצע כמילומינסנטי.

פרוטוקול עבודה בתספיג רנ"א

בידוד ה-RNA.
אלקטרופורזה:
לג'ל פורמלדהיד אגרוז - הכינו את הג'ל והכניסו את מגש הג'ל לתוך המכשיר. הוסיפו חוצץ MOPS, טענו את הדגימות ושלבו סמן משקל מולקולרי. הריצו את הג'ל ולאחר מכן חתכו את הג'ל לפני ההספגה.
לג'ל גליאוקסל אגרוז - הכינו את הג'ל והכניסו את מגש הג'ל לתוך המכשיר. הוסיפו חוצץ MOPS, הכינו דגימות וטענו אותן לשקעים עם סולם RNA.
לג'ל פוליאקרילאמיד דנטורציה - צקו את הג'ל והרכיבו אותו ביחידת האלקטרופורזה. הכינו דגימות, טענו לתוך הג'ל והפעילו עם חוצץ ריצה של TBE.

העברה:
לג'ל פורמלדהיד אגרוז או ג'ל גליאוקסל אגרוז - שטפו את הג'ל ב-SSC, ואז הרכיבו את יחידת ההעברה עם הג'ל, נייר הסינון וממברנת הניילון. כאשר ההעברה הושלמה, הניחו את הממברנה בקרוס לינקר UV.
לג'ל פוליאקרילאמיד דנטורציה - הרכיבו את יחידת ההעברה הכוללת ג'ל, נייר סינון וממברנת ניילון תוך הקפדה על הצפה ב-TBE. כאשר ההעברה הושלמה, הניחו את הממברנה בקרוס לינקר UV כדי לקבע את ה-RNA לממברנה.

טרום הכלאה (חסימה) - טרום הכלאה של הממברנה בתמיסת הכלאה.
הכלאה:
הוסיפו אמצעי בדיקה לתמיסת ההכלאה ובצעו הדגרה.
שטפו את הממברנה בעוצמה נמוכה כדי להסיר את תמיסת ההכלאה והבדיקה הלא היברידית, ושטיפות בעוצמה גבוהה להסרת מולקולות שעברו היברידיזציה חלקית.
פעלו לפי הוראות היצרן לזיהוי כמילומינסנטי.

שיטות לביצוע תספיג / בלוטינג חלבון

תספיג חלבון (Western Blot) משמש לקביעת הזהות, הגודל והכמות של חלבונים ספציפיים בתוך דגימה. פרוטוקול העבודה מתחיל בתהליך ליזיס מרקמות או מתרבית תאים, והפרדה על גבי ג'ל פוליאקרילאמיד באמצעות אלקטרופורזה.

לאחר מכן, החלבונים המופרדים מועברים לממברנת ניטרוצלולוזה או פוליווינילידן דיפלואוריד (PVDF). הממברנה מודגרת עם חומר חוסם כדי למנוע קישור לא ספציפי, ולאחר מכן עם נוגדן ראשוני כדי לקשור את החלבון הרלוונטי.

ישנן שתי שיטות זיהוי - ישירה ועקיפה:

גילוי ישיר מסתמך על נוגדן ראשוני מסומן.
גילוי עקיף מצריך נוגדן ראשוני המכוון כנגד חלבון המטרה, וכן נוגדן משני המכוון נגד רמת האימונוגלובין או תת-הרמה שלו, בסוג הנוגדן הראשוני.

שיטות ההדמיה כוללות מבחני צבע קולורימטריים בהם נוצרים משקעים צבעוניים, כמילומינסנציה ופלואורסצנציה.

פרוטוקול עבודה בתספיג חלבון

בצעו ליזיס מתרבית תאים או מרקמה.
הכנת הדוגמה לעבודה:
קבעו את ריכוז החלבון של כל דגימה בעזרת בדיקת כימות חלבון (שיטת ברדפורד).
הוסיפו נפח שווה של חוצץ Laemmli 2X לכל דוגמה.
ייתכן שיהיה צורך להפחית דגימות מסוימות או לעשות דנטורציה, על ידי הרתחת הדגימות בחוצץ.

אלקטרופורזה - הכינו ג'ל SDS-PAGE, טענו את הדגימות יחד עם סמן משקל מולקולרי והריצו את הג'ל בחוצץ הרצה.

העברה - לאחר האלקטרופורזה, הרכיבו את יחידת ההעברה הכוללת את הג'ל, PVDF או ממברנת ניטרוצלולוזה, וכן נייר סינון. העבירו את החלבונים לממברנה עם חוצץ העברה.